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還在苦惱 T 細胞分型鑒定？看這篇就夠了！
以下內容來源于“RnDSystems”微信公眾號：
免疫細胞療法包含多種利用宿主免疫反應來治療免疫疾病和癌癥的方法，其中包括 CAR-T 細胞療法、Treg 療法以及 TILs 療法。以 CAR-T 細胞療法為例，其整個工作流程如圖 1 所示，包含了 T 細胞分離、CAR 基因轉導、CAR-T 細胞培養與擴增、細胞活性檢測及 CAR 表達分析等、回輸治療、療效評估等步驟。 在整個過程中 T 細胞的分型鑒定是不可或缺的，Bio-Techne 提供 T Cell 多色流式檢測 Panel，助力您在免疫細胞療法中快速、準確地鑒定分析 T 細胞表型。 圖 1 患者特異性免疫療法流程概覽。供體的外周血單個核細胞（PBMC）樣本需經過 T 細胞篩選（Stage 1）和富集（Stage 2）處理。T 細胞經過改造以表達嵌合抗原受體（CAR）（Stage 3），從而能夠識別腫瘤細胞受體，并在收獲（Stage 5）之前于細胞培養中進行擴增（Stage 4）。最終的嵌合抗原受體 T 細胞（CAR-T 細胞）產品在重新輸回患者體內（Stage 7）之前要先進行分型鑒定（Stage 6）。 流式細胞 Panel 檢測記憶 T 細胞 樣本中各類記憶 T 細胞亞群的比例，會對機體免疫應答的擴增潛能和功能產生顯著影響。表 1 中是 Bio-Techne 提供的已驗證的多色流式細胞術檢測 Panel，針對記憶 T 細胞標志物（如 CD45RO 和 CCR7）對人 PBMC 進行表型分析。 標志物 熒光染料 貨號 CD3 mFluor? Violet 450 FAB100MFV450 CD4 mFluor? Violet 500 FAB3791MFV500 CD8 Alexa Fluor? 700 FAB1509N CD45RA mFluor? Violet 610 FAB11444MFV610 CD45RO Alexa Fluor?647 FAB10642R CCR7 PE FAB197P 表 1 檢測記憶 T 細胞的流式細胞 Panel 流式細胞 Panel 檢測 T 細胞活化 T 細胞在體外接觸到特定抗原或外界刺激時會被激活，分析早期和晚期激活標志物的表達模式，能夠加深對機體免疫反應的理解。表 2 中是 Bio-Techne 提供的已驗證的多色流式細胞術檢測 Panel，可識別 T 細胞上的激活標志物，如 CD25、CD69 和 CD38。 標志物 熒光染料 貨號 CD3 mFluor? Violet 450 FAB100MFV450 CD4 mFluor? Violet 500 FAB3791MFV500 CD8 Alexa Fluor? 700 FAB1509N CD25 mFluor? Violet 610 FAB1020MFV610 CD38 Alexa Fluor?647 FAB2404R CD69 PE FAB23591P 表 2 檢測 T 細胞活化的流式細胞 Panel 流式細胞 Panel 檢測 T 細胞耗竭 抑制性受體的表達對于調節免疫反應至關重要，然而這些受體的異常且持續表達可能會導致免疫功能異常。表 3 中是 Bio-Techne 提供的已驗證的多色流式細胞術檢測 Panel，可用于分析 T 細胞中的耗竭標志物，如程序性死亡受體 1（PD-1）、T 細胞免疫球蛋白黏蛋白分子 3（TIM-3）和淋巴細胞激活基因 3 蛋白（LAG-3）。 標志物 熒光染料 貨號 CD3 mFluor? Violet 450 FAB100MFV450 CD4 mFluor? Violet 500 FAB3791MFV500 CD8 Alexa Fluor? 700 FAB1509N LAG-3 mFluor? Violet 610 FAB23193MFV610 PD-1 Alexa Fluor?647 FAB10863R TIM-3 PE FAB2365P 表 3 檢測 T 細胞耗竭的流式細胞 Panel Bio-Techne 流式細胞 Panel 在 T 細胞免疫療法中的應用如下： （參考圖 1） 01 最初，從患者供體中分離出 PBMC。由于 CAR-T 細胞的最終產量可能會受到起始原材料的影響，因此通過流式細胞術檢測記憶 T 細胞、活化 T 細胞和耗竭 T 細胞的比例，為免疫細胞群體的異質性設定了一個基準，并且如果在工程化之前分離 T 細胞，還可以確定樣本的總體純度（圖 1，Stage 1）。 圖 2 展示了免疫細胞治療過程（圖 1）的 Stage 1 (Day 0)，供體 PBMCs 中表達記憶標志物（CD45RO/CD45RA）、激活標志物（CD69/CD38）和耗竭標志物（TIM-3/LAG-3）的 T 細胞亞群分型。 圖 2 采用流式細胞術的多色 T 細胞檢測 Panel 對 PBMC 細胞進行 T 細胞記憶、激活和耗盡的表征。冷凍保存的人（第 0 天）PBMCs 復蘇后，用三種流式細胞術檢測 panel 進行染色，以評估其在 T 細胞激活之前的初始（na?ve）、記憶、耗竭和激活表型。PBMCs 首先用 anti-human CD3 mFluor? Violet 450、CD4 mFluor? Violet 500、CD8 Alexa Fluor? 700 以及 Live/Dead 750/777 viability dye 進行染色，隨后用三種不同的檢測 Panel 分別評估 T 細胞的 1）記憶（CD45RO Alexa Fluor? 647、CD45RA mFluor? Violet 610 和 CCR7 PE），2）耗竭（PD-1 Alexa Fluor? 647、TIM-3 PE 和 LAG-3 mFluor? Violet 610），以及 3）激活（CD25 mFluor? Violet 610、CD69 PE 和 CD38 Alexa Fluor? 647）。 02 在 T 細胞激活和細胞培養擴增過程中（圖 1，Stage 2），通過流式細胞術進行免疫表型分析，用于評估 T 細胞激活的變化以及 T 細胞亞群分布的總體變化。這些變化對于理解 T 細胞工程的成功與否以及最終產品的產量至關重要。 圖 3 展示了免疫細胞治療過程（圖 1）Stage 2：擴增 T 細胞的第 2 天激活表型以及第 9 天的記憶和耗竭表型鑒定。 圖 3 采用流式細胞術的多色 T 細胞檢測 Panel 對激活的 T 細胞進行 T 細胞記憶、激活和耗盡的表征。人外周血單個核細胞（PBMCs）用生物素標記的 GMP Anti-Human CD3（貨號 MAB11411-GMP）和 GMP Anti-Human CD28（貨號 MAB11412-GMP）與 M-270 磁珠偶聯，并加入 200 IU/mL 的 GMP Recombinant Human IL-2（貨號 BT-202-GMP）刺激 9 天。第 9 天擴增的 T 細胞 anti-human CD3 mFluor? Violet 450、CD4 mFluor? Violet 500、CD8 Alexa Fluor? 700 以及 Live/Dead 750/777 viability dye 進行染色，隨后用三種不同的檢測 Panel 分別評估 T 細胞的 1）記憶（CD45RO Alexa Fluor? 647、CD45RA mFluor? Violet 610 和 CCR7 PE），2）耗竭（PD-1 Alexa Fluor? 647、TIM-3 PE 和 LAG-3 mFluor? Violet 610），以及 3）激活（CD25 mFluor? Violet 610、CD69 PE 和 CD38 Alexa Fluor? 647）。 03 流式細胞術可檢測供體 T 細胞之間的記憶、激活和耗竭標志物的差異。圖 4 展示了從第 0 天到第 2 天（用于激活）或第 9 天（用于記憶和耗竭）使用流式細胞術檢測 Panel，可以提供關于供體 T 細胞隨時間變化的定量數據。 圖 4 T 細胞記憶、激活和耗竭檢測 Panel 追蹤檢測 T 細胞群隨時間的變化。人 PBMCs 被用生物素標記的 GMP Anti-Human CD3 (貨號 MAB11411-GMP) 和 GMP Anti-Human CD28 (貨號 MAB11412-GMP) 與 M-270 Dynabeads + 200 IU/mL GMP Recombinant Human IL-2 (貨號 BT-202-GMP) 刺激 9 天，如圖 4。在激活后，分析了 Day 0（Stage1）和 Day 9（A、B）以及 Day 2（C）的 CD45RO+/CCR7+中央記憶 T 細胞（A）、PD-1+細胞（B）和 CD25+/CD69+細胞（C）的表達差異。
Bio-Techne 旗下的子品牌 R&D Systems? 及 Novus Biologicals?，可提供多達 22000+種流式抗體。其免疫細胞標志物抗體產品組合助您構建多色 T 細胞檢測 Panel，用于全面評估 T 細胞的記憶、激活和耗竭表型。 若您想要了解更多免疫細胞分型鑒定相關知識，請掃描下方二維碼申請獲取《流式細胞術鑒定人體免疫細胞指南》以及《流式技術指南》（指南涵蓋流式細胞術的技術原理、實驗設計、操作流程，全本皆干貨，流式細胞術實驗必備）。
