Western Blot——樣品制備

為確保電泳順利進行，必須有效消除蛋白質之間的聚集作用。理想的做法是在電泳樣品緩沖液中同步完成細胞裂解與蛋白溶解。若無法實現這一操作，則需在專門的增溶溶液中提取蛋白，該溶液應包含去垢劑、變性劑和/或還原劑，并使用與電泳兼容的緩沖體系。裂解緩沖液通常含有多種去垢劑，有助于破壞細胞結構、釋放蛋白質并促使其充分溶解。然而，由于不同蛋白質的理化性質各異，其對緩沖液成分及去垢劑的響應也可能存在差異。若目標蛋白未能有效溶解，或其蛋白-蛋白相互作用具有特殊性，則需嘗試其他特制緩沖液，并通過置換或去除原有去垢劑來優化溶解條件。

• 全細胞裂解物和膜結合蛋白：常用的裂解緩沖液包括RIPA和NP-40。其中，RIPA因其較強的裂解能力，特別適用于提取難溶性膜蛋白。
  

• 核/線粒體蛋白：通常優先選擇RIPA緩沖液，但為提高特定細胞器及目標蛋白的回收效率，常采用分級分離策略以增強富集效果。
  

• 細胞質蛋白：在某些情況下，Tris-HCl緩沖液可能比RIPA更具優勢，具體條件需通過實驗優化，以實現目標蛋白的最大化提取。
  

• 天然狀態蛋白質：CHAPS作為一種兩性離子去垢劑，能有效維持蛋白質的天然構象，因此廣泛應用于等電聚焦（IEF）和二維電泳（2-D PAGE）等需要保持蛋白天然狀態的技術中。

多種蛋白質可通過二硫鍵交聯形成多聚體結構。添加還原劑能夠有效斷裂這些二硫鍵，促使蛋白質解聚為單體形式。以下是幾種常用的還原劑及其典型應用場景。

細胞裂解后，胞內酶類（如蛋白酶和磷酸酶）仍具有活性，可能導致目標蛋白發生降解、去磷酸化或構象改變。為最大限度抑制這些酶的活性，樣品制備過程應全程在冰上或4℃環境下進行，并在裂解緩沖液中添加相應的蛋白酶和/或磷酸酶抑制劑。此外，裂解緩沖液建議現用現配，以確保其有效性。實驗人員既可選用市售的即用型復合抑制劑（通常為專利配方），也可根據具體實驗需求自行配制抑制劑混合液。下表匯總了常用的蛋白酶和磷酸酶抑制劑、各自的作用靶點，以及在裂解緩沖液中的推薦終濃度。

• 防止降解：離心混合后，應立即加入裂解緩沖液及蛋白酶抑制劑混合物，以有效抑制蛋白水解。為獲得較高的蛋白提取效率，有時需采用不同濃度的蛋白酶抑制劑組合，并重復裂解步驟。

• 定量樣品：測定樣品中總蛋白含量有助于確保各泳道上樣量一致，從而實現均等電泳加載。在需要比較不同處理組（如對照與實驗組）中目標蛋白表達水平時，準確的定量尤為重要。保持上樣量一致可減少后續數據分析中的歸一化誤差。

• 去除不溶物：固體顆粒可能堵塞凝膠孔道，影響電泳效果。因此，在電泳前需將裂解后的細胞勻漿在15°C下以20,000 ×g離心15分鐘，以充分沉淀并去除所有不溶性成分。