揭秘WB | 蛋白電泳總翻車？先搞懂蛋白質分離的秘密

來源: | 作者:/ | 發布時間: 2026-01-30 | 107 次瀏覽 | 分享到:

Western Blot——蛋白電泳

做Western Blot實驗的你，是否也遇到過這樣的窘境：樣品制備小心翼翼做到位，最終條帶卻模糊不清、拖尾嚴重，甚至目標蛋白“跑丟”了？問題很可能出現在電泳環節！上一篇我們已經成功解鎖樣品制備，從細胞組織中提取、定量目標蛋白，得到狀態穩定的蛋白樣品，但此時它們仍像一群雜亂無章的“小家伙”，擠在樣品孔里難分彼此。而電泳，就是給這群“小家伙”精準“排兵布陣”的關鍵一步。電泳的每一個細節都直接影響后續條帶質量，甚至決定實驗成敗。今天我們就聚焦常用的幾種電泳方法，帶你摸清蛋白分離的底層邏輯。

蛋白質電泳遷移影響因素

在蛋白電泳過程中，蛋白質在電場作用下遷移，穿過由水性聚合物（如聚丙烯酰胺）構成的凝膠基質中的孔隙。凝膠的孔徑大小對蛋白質的遷移行為具有顯著影響。總體來說，蛋白質在凝膠電泳中的遷移速率主要受以下因素影響：

· 凝膠濃度（聚合物質量百分比）：決定孔徑大小；

· 電場強度：影響遷移速度；

· 溫度：過高容易導致條帶變形或凝膠熔化；

· 蛋白質自身的理化特性：包括大小、形狀和電荷，其中電荷又受緩沖液PH、離子強度以及是否添加變性劑（如SDS）或還原劑（如β-巰基乙醇）等因素調控。

聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)

絕大多數蛋白質分離方法均采用水性聚丙烯酰胺凝膠作為分子篩，該技術也因此得名——聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。在電場作用下，蛋白質遷移通過凝膠網絡，其孔徑結構對不同大小的分子產生產生篩分效應：小分子蛋白遷移較快，大分子則較慢，從而實現基于分子量的物理分離。

典型的PAGE裝置中，凝膠夾置于上下兩個緩沖液室之間，電場僅能通過凝膠形成通路。凝膠通常垂直放置（故稱垂直電泳），澆注時插入梳子以形成加樣孔。施加電壓后，帶負電的蛋白質從上樣孔進入凝膠并向陽極遷移。為便于監測進程，樣品中常加入示蹤染料（如溴酚藍），其在凝膠中的前沿位置可直觀反應電泳進度。若電泳時間過長，目標蛋白可能遷移出凝膠底部，導致信號丟失。

聚丙烯酰胺凝膠中蛋白質電泳分離示意圖

非變性凝膠電泳(Native-PAGE)

非變性PAGE(Native PAGE)是一種在不含變性劑（如SDS）和還原劑（如β-巰基乙醇）的條件下進行的蛋白質電泳技術，樣品通常使用非還原性、非變性緩沖液制備。在此條件下，蛋白質維持其天然構象、電荷狀態及亞基間相互作用。因此，其遷移行為不僅取決于分子大小，還受固有電荷、形狀以及是否形成多亞基復合物等多重因素影響。

由于保留了天然凈電荷，不同蛋白質可能朝向不同電極遷移（通常在堿性PH下整體帶負電而向陽極移動），且復合物的遷移模式往往難以預測。這種方法適用于研究蛋白質的天然狀態、寡聚化形式及其相互作用。

變性凝膠電泳(SDS-PAGE)

SDS-PAGE是一種常用的電泳方法，該技術將去垢劑十二烷基硫酸鈉(SDS)加入緩沖液中。在SDS與變性劑（如還原劑）的共同作用下，蛋白質的二硫鍵被打開，并完全解聚為多肽鏈。此外，SDS通過非共價方式與蛋白質結合，賦予其一系列有利于電泳分離的新特性：